[유전자실험]Competent Cell 만들기

소개글

유전자실험- competent cell 만들기에 관한 실험보고서

목차

1. 실험목적
2. 실험원리
① Fresh frozen 방법
② Calcium chloride 이용법
<competent cell에 이용되는 strain>
① DH1
② DH5
③ DH5α
④ MM294
⑤ JM109
⑥ CJ236
⑦ TH2
⑧ MV1184
⑨ HB101
<Transformation의 efficiency>

3. 실험재료
4. 실험방법
5. 참고문헌

본문내용

박테리아가 DNA를 cell 내부로 흡수하여 형질이 전환되는 것을 transformation이라고 하며, 그 능력을 향상시키기 위해 cell에 물리․화학적인 변화를 주어 외부 DNA를 더 잘 흡수하도록 만든 상태가 competence 상태이다. competence 상태는 자연적으로 일어나기도 하지만 여러 가지 실험적 방법을 사용해 인위적으로 만들 수 있다. 따라서 재조합 DNA의 형질 전환을 위해 E.coli의 competent cell을 미리 제조하여, E.coli가 외부의 free DNA를 받아들일 수 있는 상태로 만들어 주는 실험을 행하면서, competent cell이 어떤 방식으로 만들어지는지 알아보고자 한다.

1. 실험원리

대부분의 박테리아는 일반적으로 제한된 양의 DNA만을 흡수하며, E.coli는 linear 또는 circular DNA를 받아들일 수 있는데 이러한 과정을 transformation이라고 한다. 이 능력을 더 향상시키기 위하여 물리․화학적 처리를 한 상태의 세포를 competent cell이라고 한다. 특정 균주만이 competence를 가지고 있으며 그 능력은 유전된다. 더구나 competence의 능력은 세포의 생리적 상태와 생장된 배지에 의해 영향을 받으며 생장주기 단계에 따라 다양하다.
미생물은 생장주기 단계에 따라 생육곡선(growth curve)이 있는데, 이는 미생물을 배양할 때 배양시간과 생균수의 대수(log) 사이의 관계를 나타내는 곡선으로 유도기, 증식기, 안정기, 사멸기로 나누어진다. 그 중 사멸기는 생균수가 감소하며 영양분이 없어진 미생물은 자가소화를 하게 된다. 이 때 증식기 동안 세포 표면이 변화하므로 DNA가 그 표면에 쉽게 결합할 수 있게 된다. 또 세포가 가장 민감한 상태이므로 물리․화학적 처리로 쉽게 competence 상태를 만들 수 있다.

박테리아를 형질전환(transformation)시키는 대부분의 방법은 수많은 과학자들이 경험적으로 정리한 것이며 그 기전은 정확히 알려지지 않았다. 현재 실험실에서 competent cell을 제조하는 방법으로 다음과 같은 두 가지가 주로 사용된다.

① Fresh frozen 방법
DH1, DH5, MM294등의 E.coli를 높은 효율(5×108 transformed colonies/μg of supercoiled DNA)로 형질 전환시킬 수 있으며, strain에 따라서 효율이 떨어지기도 하지만 사실상 거의 모든 경우에 사용할 수 있는 방법이다.

참고 자료

① 생명과학 편찬 위원회, 아카데미 생명과학 사전, 아카데미 서적, 2003, p.858
② 민경희 외, 대학 미생물학, 탐구당, 1990, p.238~243
③ 김영민 외, 미생물학-6판, 라이프사이언스, 2005, p.322~324
④ 강종백 외, 유전자 클로닝 입문, 월드사이언스, 2004, p.92~9