Insert purification and Plasmid DNA extraction

소개글

플라스미드 DNA의 추출과 삽입 DNA의 정제

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Material & Method
4. Result
5.Discussion

본문내용

1. Abstract
- 이번 실험은 PCR 실행 후 다량으로 복제된 DNA를 Vector에 삽입하기 전 정제하는 과정과 우리가 원하는 이 DNA를 삽입 할 때의 운반체가 될 Vector인 Plasmid의 DNA를 추출 하는 실험이다. 이번 실험을 통해 우리가 원하는 DNA를 Vector에 삽입할 수 있는 상태로 만들 수 있고 삽입하기 전 Vector로 사용되는 Plasmid의 DNA를 추출해 삽입하기 바로 전 과정까지 마칠 수 있다.
Plasmid의 DNA를 추출 하는 과정은 먼저 배지를 준비하는데 이 배지는 LB배지 10ml에 Amp 10μl(50mg/ml stock)와 pET11a in DH5-α(E. coli) 100μl를 넣고 하루 밤 배양을 시킨다. 그리고 Cell을 Conical tube에 넣고 10분 동안 3750rpm으로 centrifuge 한다. Centrifuge후 상층액은 버리고 pellet을 취해 Resuspension buffer 0.5ml을 넣고 잘 섞어준다. 다음 Lysis buffer 0.5ml을 넣고 inverting 하는데 5분을 넘지 않는다. 그리고 Neutralization buffer를 0.7ml 넣고 inverting 하고 e-tube에 850μl 씩 나누어 놓고 12000rpm, 4℃에서 20분간 centrifuge 한다. centrifuge 후 이번에는 상층액을 따서 column에 넣고 centrifuge 한 후에 하층액을 버리고 colum을 다시 끼운다. 이때 한번에 약 800μl 씩 넣고 centrifuge 1분을 반복한다. 그리고 Washing buffer A를 500μl 넣고 1분간 centrifuge하고 Washing buffer B를 700μl 넣고 1분간 centrifuge하고 다시 Washing buffer B를 500μl 넣고 1분간 centrifuge 한다. 그리고 column의 막을 말려주고 중심부에 Elution buffer 50μl를 넣어주고 3분 기다린 후 1분 centrifuge하고 전기영동을 한다.
PCR product를 정제 하는 과정은 PCR product에 binding buffer를 500μl 넣고 잘 섞은 후 실온에서 1분 동안 두고 이것을 column에 넣고 centrifuge 1분 한다. centrifuge 후 하층액을 버리고 다시 column에 끼우고 Washing buffer를 700μl 넣어주고 centrifuge 1분 한다. 마지막으로 e-tube에 column을 끼우고 Elution buffer를 50μl 넣고 3분 기다린 후 1분간 centrifuge하고 전기영동을 한다.

참고 자료

①http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_11.php
②http://blog.naver.com/kuzizi5/100008403648
③http://www.seamatrix.co.kr/wizboard.php?BID=info&mode=view&UID=36&CURRENT_PAGE=1&BOARD_NO=32&SEARCHTITLE=&searchkeyword=&category=
④Brock Biology of Microorganisms 11판 / Madigan / Pearson Education Asia / 275~275쪽, 288~289쪽
⑤Reproductive & developmental biology 25권 3호 / 강용국 외 4명 / 한국동물번식학회 / 237~212쪽