연세대학교 생화학실험(2) - Purification of Thermostable DNA Polymerase

소개글

E.coli Transformation을 이용해 Taq polymerase를 overexpression시키고 Taq polymerase의 성질을 이용해 purification한다.

목차

◆ 실험일자
◆ 제출자
◆ 목적
◆ 원리
◆ 시약 및 기자재
◆ 방법
◆ 결과
◆ 고찰

본문내용

◇ 목적
E.coli Transformation을 이용해 Taq polymerase를 overexpression시키고 Taq polymerase의 성질을 이용해 purification한다.

◇ 원리
<Taq polymerase>
- 호열균인 Thermus aquaticus에서 얻은 94kDA의 Thermostable한 효소.
- 75~80℃에서 optimal activity를 가지며 95℃에서의 반감기는 40분정도.
- 활성을 가지려면 마그네슘 이온이 필요하며 5`→3`으로 DNA를 합성, primer 제거 가능.
- 3`→5` exonuclease activity가 없어 proof reading을 하지 못함.
- Tamplate에 상보적인 DNA 합성이 끝나고도 3` end에 주형 없이 A를 붙임.
<Taq Pol 분리 방법>
- Taq Pol의 thermostable한 성질을 이용함.
- Taq Pol은 DNA에 binding한 상태로 존재하므로 PEI를 이용하여 침전시키고, ion-exchange chromatography를 이용하여 분리한다.
- PEI precipitation : PEI는 ethyleneimine이 polymer를 이룬 highly branched protein 으로, negative charge를 띈 분자들을 잡아당겨 산성이나 중성의 pH 조건에서 (-)charge를 neutralization한다. 이 능력 때문에 DNA에 강하게 binding하여 Taq Pol.과 함께 침전한다. 분리된 침전물에는 적절한 농도의 salt를 처리하여 DNA와 Taq Pol.을 분리한다.
- ion-exchange chromatography : Ion화 되어있는 molecule과 binding하는 bead로 만들어진 column으로 cation exchanger와 anion exchanger 두 가지가 있다. 이번 실험에서 사용한 Bio-rex 70의 경우에는 weak cationic exchanger로 carboxylic acid exchange group을 가진 (-)charged bead가 PEI와 binding하는 능력을 이용한다.

참고 자료

- 교육과학기술부의 생명특성화사업단, 생화학실험(2) 실험교본
- http://en.wikipedia.org/wiki/Taq_polymerase