PCR

소개글

PCR

목차

-PCR의 3단계-
Real time PCR
Hybridization
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
ISPCR (In Situ Polymerase Chain Reaction)
DDRT-PCR (Differential Display Reverse Transcriptase PCR)

본문내용

1. DNA의 변성(Denaturation)
90~96℃로 가열하여 double strand DNA(dsDNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨 다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA Polymerase로 온도가 아주 높은 상 태에서는 활성이 낮아질 수 있으므로 보통 94℃에서 한다. 첫 cycle에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시키도록 한다.

2. Primer의 결합(Annealing)
50~65℃에서 진행한다. 염기간의 결합은 G와 C에서는 세군데에서 수소결합이 일어나고 A 와 T에서는 2군데에서 수소결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는 것 이 좋다. annealing 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소인데 만약 온도를 너무 높게 하면 primer가 template에 너무 약하게 결합되어서 증폭된 DNA의 산물이 매우 적어진 다. 또 만약 온도를 너무 낮게 하면 primer가 nonspecific 하게 결합하기 때문에 원하지 않 는 DNA가 증폭될 수 있다.

3. DNA의 합성(Polymerization)
70~74℃에서 시행하며 열에 강한 DNA polymerase가 template DNA에서 새로운 DNA를 만 들게 된다. 원하는 PCR의 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연 장하는 것이 좋다. Taq DNA Polymerase는 보통 1분에 2,000~4,000nucleotide를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1kb마다 1분정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. cycle이 계속되면서 효소활성이 감소할 수 있고 DNA산물은 점점 많이 존재하게 된다

참고 자료

없음