direct evolution

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direct evolution의 개요

본문내용

- DNA suffling을통한 Directed evolution은 새로운 돌연변이를
만드는데 강력한 수단임.
- E.coli의 B-galactosidase와 B-glucuronidase를 많이 사용함.
- DNA suffling을 이용해 5개의 mutants를 얻음.(YG 6764, YG 6768,
YG 6769, YG 6770, YG 6771)
- 이 mutants를 얻기위해 두번의 DNA suffling과 screening 시행.
- 변종의 경우B-galactosidase보다 B-glucuronidase의 활성이 더 좋음.
- 14개의 핵산 부위에 돌연변이 일으킴.
- 10개의 amino aicd가 바뀜.(S193N, T266A, Q267R, V411A, D448G, G466A, L527I, M543I, Q626R, Q951R)
- 이 mutants의 protein을 발현, 정제 하여 W.t과 비교실험.
- B-galactosidase보다 안정성이 좋고, 무독성인 B-glucuronidase.
Materials & Methods
-50-100bp조각을 10% PAGE로 전기영동.
-Primer를 없는것과 R3742, R3743을
이용한 것으로 구분한 PCR.
-변종 DNA를 E.coli에 전이 전기영동
LB plate(ampicillin첨가), 37도에서 16시간 배양
colony 는 nitrocellulose filter에 걸러짐
이 filter를 다시 배양(0.4mg/ml X-Gluc에서 37도, GUS 버퍼)
총 2번의 screening을 거쳐 mutant 5종 골라냄.
Results
14개 부분의 핵산 변화.
이것은 10개의 amino acid의 변화.
pNPG와 oNPG를기질로 사용했을때 온도에따른 활성비교그래프. (fig 3a는pNPG, fig 3b는 oNPG)
각 mutants와 wt마다
최적의 활성을 보이는 온도가 다름.

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