protein biochemistry - Purification of GST fusion protein

소개글

GST 단백질을 이용해 원하는 단백질을 분리, 정제하는 실험에 대한 생화학 실험 보고서

목차

Ⅰ. Introduction
Ⅱ. Meterial & Method
Ⅲ. Result
Ⅳ. Discussion
Ⅳ-⑤ 단백질 정량의 여러 가지 방법
ⅴ. Reference

본문내용

Protein Bio Chemistry - Purification of GST fusion protein
Ⅰ. Introduction
분자생물학의 발달로, 생명체를 이용해 원하는 단백질을 합성할 수 있게 되면서, 생물학의 눈에 띄는 발전이 가능해졌다. 원하는 단백질을 합성하는 것만큼이나 중요한 것이 이를 분리하고, 정제하는 일이며, 이를 통해 단백질의 활성도를 측정하거나, 나아가서는 경제적 가치를 창출할 수도 있다. 본 실험에서는 GST를 발현하는 gene에 확인하고자 하는 다른 단백질을 coding하는 gene을 붙여 GST가 그 protein을 찾아내는 표지 역할을 하도록 하는 system을 사용하였으며, 실험 절차의 간소화를 위해 별도의 단백질을 fusion하지 않고, GST 자체를 분리하였다. 총 3주에 걸친 실험에서 IPTG로 GST 발현을 induction하고, GST purification하면서 각 단계별로 sample을 얻었으며, SDS page를 이용해 이들 sample 내의 GST 존재 여부를 확인함과 동시에, 그 대략적인 양을 계산하고자 하였다.
각각의 sample에 대한 실험결과는 예상한 바와 거의 동일한 band pattern으로 나타났으며, 농도를 알고 있는 BSA를 이용해 추정한 정제된 GST의 양은 정제 순서대로 6,5,1으로 확인되었다. 만약 GST에 다른 단백질이 fusion되어 있고, 이 단백질을 정제하는 것이 목적이었다면 그 단백질로부터 GST를 분리하는 추가적인 실험이 필요하지만, 본 실험에서는 GST 자체의 발현을 확인하였으므로 생략할 수 있었다.
Ⅱ. Meterial & Method
① 조교님들께서 미리 배양해주신 e-coli들이 포함된 ampicilin LB 배지 100를 다른 e- tube로 옮기고, 5000rpm에서 1분간 spin down 한 뒤 supernatant를 제거한다. down 된 cell들을 32 1X SDS sample buffer에 풀어 -IPTG (sample1)을 준비한다.
②

참고 자료

- 곽주원, <<분자생물학 노트>>, 도서출판 한림원, p.p 158~162
- 강전아인 <<단백질실험노트 상 추출, 분리 및 재조합 단백질의 발현>>, 월드사이언스, p.p.30-35, p.p.173-178
- Pink, M.; Verma, N.; Rettenmeier, A.W.; Schmitz-Spanke, S. , "CBB staining protocol with higher sensitivity and mass spectrometric compatibility", (2010) Electrophoresis 31: p.p 593598
- Switzer RC 3rd, Merril CR, Shifrin S (Sep 1979). "A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.". Anal Biochem. 98 (1): 231237.
- Sypro Rubi protein gel staining - Moleculer probesTM 에서 발행한 Product information. 20-June-2005.
- Protein Assay technical handbook, Pierce, December-2005