β-galactosidase 효소의 특성

소개글

여기서 다룰 두 가지 실험은 하나는 β-galactosidase를 이용한 enzyme kinetics assay를 통해 Vmax와 Km의 개념을 이해하는 것이었고, 두 번째 실험은 β-galactosidase의 온도와 pH에 따른 반응속도를 알아보는 것이었다. 우리가 사용한 substrate는 ortho-Nitrophenyl-β-galactoside, ONPG이고, β-galactosidase에 의해 galactose와 ONP(o-nitrophenyl)로 분해 된다. 우리는 ONPG의 농도에 변화를 주면서 반응 정도를 파악하여 β-galactosidase의 K과 V를 구했다. 이 때 반응 정도를 파악할 수 있었던 것은, 반응이 일어나면 ONP가 생성되는 데, 이 ONP는 alkaline solution 환경에서 노란색으로 발색 작용을 일으키기 때문이다.

목차

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본문내용

여기서 다룰 두 가지 실험은 하나는 β-galactosidase를 이용한 enzyme kinetics assay를 통해 V와 K의 개념을 이해하는 것이었고, 두 번째 실험은 β-galactosidase의 온도와 pH에 따른 반응속도를 알아보는 것이었다. 우리가 사용한 substrate는 ortho-Nitrophenyl-β-galactoside, ONPG이고, β-galactosidase에 의해 galactose와 ONP(o-nitrophenyl)로 분해 된다. 우리는 ONPG의 농도에 변화를 주면서 반응 정도를 파악하여 β-galactosidase의 K과 V를 구했다. 이 때 반응 정도를 파악할 수 있었던 것은, 반응이 일어나면 ONP가 생성되는 데, 이 ONP는 alkaline solution 환경에서 노란색으로 발색 작용을 일으키기 때문이다. 발색 작용을 나타내면, 420 nm에서 흡광도를 측정하게 되면 ONP의 농도에 따라 흡광도가 변화하게 된다. 즉, 반응 정도에 따라 O.D. 값이 변하게 되므로 반응 정도를 알 수가 있었다. 그리고 K과 V를 구하는 데 사용된 식은 Michaelis-menten equation이다. 정확한 이 두 가지 값을 얻기 위해서는 이 식에 역수를 취한 Lineweaver-Burk equation으로 계산을 한다. 얻는 방법은 20분 이상 완전히 반응한 반응 액의 경우, [ONPG]=[ONP]가 동일하므로 이 때의 흡광도를 이용하여 A=εcl 식을 이용하여 ε를 구하고, 이 값과 우리가 구한 ONPG 농도에 따른 흡광도 값을 이용하여 생성물의 농도 변화 그래프를 그려 기울기를 구한다. 이 때 기울기가 V값이 되고, 이를 Lineweaver-Burk equation에 대입하여 V 값과 K의 값을 구할 수가 있다. 또 Lowry assay로 cell extract내의 단백질 양을 구하여 specific activity를 구하였다. 두 번째 실험에서는 같은 기질과 효소를 이용하여 한번은 온도를 달리해서 O.D.값을 측정하여 반응 속도를 얻고, 또 pH를 달리해서 O.D.값을 측정하여 반응 속도를 얻어서 최적온도와 최적 pH를 얻었다. 최적 온도는 30 ℃, 최적 pH는 7.7로 나타났다.

참고 자료

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