실험2. Plasmid 분리, restriction digestion 및 agarose gel electrophoresis

목차

가) 실험 이론과 원칙
① 실험 목적
② Plasmid Miniprep
③ EDTA
⑤ Potassium acetate
⑥ DNase, DNA 가수분해효소
⑦ restriction enzyme
⑧ agarose gell electrophoresis
⑨ Blotting

나) 실험 재료 와 방법
① 실험 재료
② 실험 방법

다) 실험 결과

라) 고찰과 결론

마) 참고 문헌

본문내용

가) 실험 이론과 원칙
① 실험 목적
Recombinant DNA technology에 많이 이용되는 plasmid를 E.Coli로부터 miniprep으로 소량 분리한 다음, 각각 다른 restriction enzyme으로 끊어 각 restriction enzyme의 restriction map을 그리는 방법을 배운다.
② Plasmid Miniprep
mini prep은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다. 가장 보편적으로 사용되는 방법은 Alkaline method이다. 기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것이다. 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 분리하는 것이다. chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다.

<중 략>

전기영동을 이용하여 sample의 크기를 구할 때는 조건이 2가지 있다. 첫 째, sample에서 제한효소가 자를 수 있는 자리는 모두 잘려야 한다. 둘째, 잘린 조각의 크기가 모두 서로 달라야 한다. 전기영동을 이용하면 같은 크기의 절편이 몇 개인지는 알 수 없기 때문이다.
⑨ Blotting
DNA는 투명하고 크기가 작기 때문에 blotting을 하지 않으면 전기영동을 했을 때 시각적으로 볼 수 없다.
본 실험에서는 EtBR(Ethidium Bromide)을 이용하였다. EtBR은 그림에서 볼 수 있듯이 base 사이에 intercalation 하기 쉬운 평면 구조를 가진다. EtBR은 fluoroscense를 지니기 때문에 UV를 쬐어주면 빛을 낸다. 이를 이용하여 gell 위에 있는 DNA의 위치를 확인한다. EtBR이 intercalation 하지 않은 부분은 검게 나타난다.

참고 자료

http://en.wikipedia.org/wiki/Plasmid_preparation#Minipreparation
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=293177&cid=359&categoryId=359
(한국식품과학회, 식품과학기술대사전, 광일문화사, 2008.4.10)
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=1174460&cid=200000000&categoryId=200003021(두산백과)
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=1261192&cid=200000000&categoryId=200000864(두산백과)
Pamela C. Champe, 리핀코트의 그림으로 보는 생화학, 제 4판, 도서출판 신일북스 2009년, 465쪽-466쪽 이종원, 생화학 실험 교재, 대구 가톨릭 대학교 의과대학, 19쪽-28쪽