분자생물학 실험] RNA PURIFICATION & ISOLATION

목차

1.Date
2.Title
3.Purpose
4.Introduction
5.Material
6.Method
7.Result
8.Discussion
9.Reference

본문내용

3.Object. 유전자 발현의 양상과 메커니즘 연구에 필수적 과정 (노던블롯 분석, RNase 보호분석, RT-PCR과 cDNA 제작 및 in vitro번역실험 수행)을 수행하기 위해 cell 안에서 RNA를 추출한다.
4.Introduction
(1)RNA 분리 일반사항
•유전자 발현의 양상과 메커니즘 연구에 필수적 과정을 위해 노던블롯 분석, RNase 보호분석, RT-PCR과 cDNA 제작 및 in vitro번역실험 수행
•rRNA = 80~85%
tRNA, miRNA, snRNA = 15~20%
mRNA = 1~3%
•세포나 조직의 분쇄, 단백질의 분해와 제거, RNA의 농축과 양과 질 검정

(2)RNA 분리원칙
1.Rnase로부터 RNA를 보호
2. 세포가 파괴되면서 나오는 endogenous RNase 방지
3. 단백질을 제거한다. Phenol/Chloroform의 처리
4. DNA로부터 선택적으로 RNA를 분리한다. Salting out and centrifuge

(3) RNASE의 오염 및 제거
내부로부터 RNase 억제하고 외부로부터 오염된 RNase의 제거해야한다.
diethyl pyrocarbonate(DEPC)

(4) 전체(TOTAL)RNA의 분리 방법
*TRIZOL을 이용한 분리
Trizol reagent에는 monophasic phenol 과 guanidinium thiocyanate 내포되어 있다. Penol과 guanidinium thiocyanate로 세포를 터뜨려 기능을 변성시킨 후 히스톤을 분리한다. 이 때, RNA를 Rnase로부터 보호하는 것이 중요하다.
* mRNA의 분리
일반적으로 전체 RNA의 1~3% 정도가 mRNA이며 cDNA library제작과 같은 실험을 위해서는 전체 RNA로부터 mRNA를 분리하는 것이 필수이다.

참고 자료

박철희, 2006, 미생물학실험
Joanne M.Willey, Linda M. Sherwood, 2012, 미생물학
James D. Watson 외 5명, 바이오사이언스, 2010, 왓슨 분자생물학