GFP의 발현, 정제, 정량

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Material & Method
4. Results
5. Discussion

본문내용

Abstract-
이번에 하게 된 실험은 여러 실험에서 유용하게 사용되는GFP (Green Flourescent Protein) 를 발현 시키고 이를 정제해서 여러 가지 method를 통해 정량하는 것이 목적이었다. GFP를 발현시킨 후, 쉬운 정제를 위하여 affinity chromatography를 사용하기 위하여, E.coli에 단순한 GFP가 아닌 C-terminal His tagged GFP:: pET vector construct를 transformation 하였고, 이때 사용한 E.coil는 BL21(DE3)였다.
1회차 실험에서는 GFP가 E.coli내에서 발현되도록 E.coli를 접종한 과정을 거친 후에, 발현된 대장균을 골라낼 수 있도록 kanamycin를 resistant로 사용하였다. 선별된 cell을 다시 배양한 후에 목표로 한 단백질의 과발현을 위해서 IPTG를 첨가하여 induction과정을 거친 후, 충분하게 모인 cell들을 sonication buffer에 넣은 후에 voltexing한 후 resuspension후 centrifuge를 하여 영하 70도씨 조건에서 보관하였다. 2회차 실험에서는 수집한 cell을 파괴하고 target protein을 정제하는 과정을 거치는데, 이 때 cell을 파괴할 때 sonication이라는 method를 사용한다. Cell을 파괴할 때 초음파(10~20kHz)를 사용한다. Sonication 과정에서 목표 단백질이 protease때문에 분해 될 수도 있기 때문에 이를 방지하기 위해서 serine protease를 저해하는 PMSF를 넣어준다. Sonication 후에 얻어진 protein 중에서 target protein만을 얻어내기 위하여 column에서 His-tag와 결합할 resin과 target protein을 binding하여 나머지를 제거한 후, 이 과정으로 얻은 protein에 imidazole을 첨가하며 resin에서 분리한다. 3회차 실험에서는 정제한 GFP를 정량한다.

참고 자료

David P. Clark, 알기 쉽고 재미있는 분자생물학, 라이프 사이언스, pp 230~243
각종 figure, 참고사항-http://en.wikipedia.org
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