[A+ 리포트] Stripping, beta-actin Detection

소개글

본 리포트는 western blot의 과정 중 마지막 단계로 stripping과 beta-actin detection에 관한 실험 과정과 방법이 구체적으로 기술되어 있습니다.

참고하시어 좋은 결과 쟁취하시기 바랍니다.

목차

1. Date

2. Title

3. Purpose

4. Materials

5. Method
가. Stripping
나. Antibody (항원-항체 반응)
다. Detection

6. Result
가. chemi-doc을 이용하여 찍은 protein marker와 sample의 결과 사진
나. 두 sample의 ATG5 protein과 beta-actin 합성 여부에 따른 Detection 결과

7. Discussion
가. Stripping의 원리
나. loading control로 beta-actin이 사용된 이유

8. Remark

9. Reference

본문내용

2. Title : Stripping & β-actin Detection

3. Purpose :
가. Stripping을 통해 기존에 부착되어 있던 antibody를 제거하여 membrane의 다른 protein을 detection할 수 있음.
나. 새로운 antibody를 membrane에 부착하고 ECL에 반응시켜 β-actin의 band를 확인할 수 있음.

4. Materials : 12주차 실험의 membrane, 1N NaOH, 마이크로 피펫, 피펫팁, S1 pipette filler, TTBS, 폐기통, 5% skim milk, β-actin antibody, 15ml conical tube, ECL, 킴테크 와이퍼, 집게, 1.5ml tube, 70% 에탄올

5. Method :
가. Stripping
1) 12주차 실험에서 Detection했던 membrane을 준비함.
2) 1N NaOH 1ml를 membrane이 있는 western blot box에 가해 15초 동안 stripping함.
3) Stripping한 용액을 버리고 TTBS로 간단히 washing함.
4) TTBS 10ml로 10분간 총 5번 washing함.
5) 과정 4)가 모두 완료되면 western blot box에 남아 있는 TTBS를 폐기통에 버리고, 5% skim milk 10ml로 2시간 Blocking함.
6) Blocking했던 skim milk를 버리고, TTBS로 간단히 washing함.

나. Antibody (항원-항체 반응)
1) 5% skim milk : β-actin antibody = 1,000 : 1의 비율로, western blot box에 5% skim milk 10ml와 β-actin antibody 10㎕를 넣음.
(본 실험에서 사용한 β-actin antibody는 HRP가 conjugation된 primary antibody이므로 secondary antibody를 추가적으로 붙이지 않아도 됨)

참고 자료

Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang, NCBI, “Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting”, North American Journal of Medical Sciences, 2012.
생화학분자생물학회 저, 『생화학백과』, 생화학분자생물학회, 2019, 145, 348면.
Sino Biological, “Western Blot Troubleshooting Guide: Low Signal or No Signal”, 2020.06, https://www.sinobiological.com/category/wb-troubleshooting-low-signal.
proteintech, “Troubleshooting weak/no signal & other”, 2020.06, https://www.ptglab.com/support/western-blot-protocol/western-blot-troubleshooting-weakno-signal-other/.