[분자생물학실험]6X His tagged eGFP 단백질의 발현 및 정제와 단백질의 정량 및 정성적 특징 확인

소개글

"[분자생물학실험]6X His tagged eGFP 단백질의 발현 및 정제와 단백질의 정량 및 정성적 특징 확인"에 대한 내용입니다.

목차

1. 실험 이론 및 원리
1) 실험 소개
2) 실험 요약

2. 실험 방법
1) 실험 과정

3. 실험 결과
1) 결과 분석

4. 토의 사항
1) 실험 고찰

본문내용

일반적으로 살아있는 단일 세포에서 매우 빠른 생화학적 변화를 관찰하기 위하여 형광 탐침이 사용된다. 많이 사용되고 있는 한 방법에서 형광 탐침들이 천연 형광 단백질인 해파리 의 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein,GFP)로부터 얻어진다. GFP는 빛 광자 흡수에 의하여 흥분되었을 때 빛띠의 녹색영역에서 광자(즉 형광)를 방출한다. GFP는 11가닥의 barrel 구조이고, 단백질의 빛 흡수/방출 센타는 세린65-타이로신66-글라이신67 세개의 펩타이드로 구성되어 있으며 이것은 통 내부에 위치한다.

다은 형광 빛띠를 갖는 이 GFP 변형체들은 GFP 유전자의 유전공학에 의하여 생성될 수 있다. 본 실험에서는 64번째 아미노산이 페닐알라닌에서 류신으로, 65번째 세린이 트레오닌으로 변형된 EGFP(Enhanced GFP)를 사용한다. EGFP의 최대흡광파장은 488㎚이고, 최대발광파장은 509㎚이며 293개의 아미노산으로 이루어진 32.7kDA monomer이다.

GFP와 같은 단백질들을 분리하고 정제하기 위해 쓰는 방법 중 하나가 tagging이다. 6X His tag는 붙이고자 하는 단백질의 N-terminal 또는 C-terminal에 6개의 히스티딘을 붙이는 것으로 상대적으로 크기가 작기 때문에 단백질에 큰 영향을 주지 않는다. GFP에 tagging한 히스티딘 6개는 전이 금속 이온과 상호작용하여 히스티딘의 N과 배위결합을 형성한다. 원하는 단백질인 GFP를 E.coli에서 과발현으로 얻었을 때, GFP는 현재 E.coli 내부의 다른 단백질과 섞여있다. 이러한 단백질을 분리하고 정제하기 위해 쓰는 친화 크로마토그래피 (Affinity chromatography)는 단백질의 결합특이성에 바탕을 두고 있다. 만약 리간드와 붙는 물질이 금속이온인 경우에 이를 IMAC(Immobilized metal ion affinity chromatography)라고 한다.

참고 자료

David L. Nelson, Michael M. Cox, 2004, Lehniger Principle of Biochemistry(4th ed), WORLD SCIENCE Co, pp.88-95
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