[일반생물학] Gene cloning의 과정

소개글

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목차

Ⅰ. 원하는 유전자준비
1) GeneBank에서 유전자 검색
2) Genominc DNA분리
3) Polymerase Chain Raction(PCR)
* PCR에서 필요한 재료
* PCR 의 원리
① DNA의 변성(denaturation)
② Primer의 결합(annealing)
③ DNA의 합성(polymerization)
4) PCR의 산물의 전기영동(electrophoresis)
PCR product purification

Ⅱ. 얻은 유전자를 vector에 삽입
1) Vector
※ Vector의 기능
※ Vector의 종류
2) Restriction enzyme
※ Recombinant DNA
※ 제한효소 (restriction enzyme)
3) DNA ligation과 T-vector를 이용한 PCR product의 cloning

Ⅲ. 유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입
1) Transformation
※ Competent cell
※ 박테리아의 형질전환
2) 항생제와 LacZ를 이용한 seletion
Plasmid의 구성 - 크게 세 부분으로 구성
※ 항생제를 이용한 selection
LacZ를 이용한 color selection

Ⅳ. 올바른 clone 선택
1) Plasmid DNA 분리
Supercoiled (closed circular) DNA와 open circular DNA
2) Restriction enzyme mapping
3) DNA sequencing
4) Gene cloning의 결과

본문내용

Ⅰ. 원하는 유전자준비
1) GeneBank에서 유전자 검색
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html
2) Genominc DNA분리
DNA extracting methods
3) Polymerase Chain Raction(PCR)
중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하다.

* PCR에서 필요한 재료
① Template DNA : 증폭 대상이 되는 DNA
② 한 쌍의 primer : 증폭할 부분을 잡는 짧은 oligonucleotide
③ dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) : 유전자를 합성하는 재료가 되는 nucleotide들
④ Taq polymerase : 열에 특별히 강한 유전자 합성효소

* PCR 의 원리
중합효소 연쇄반응은 다음의 세 단계로 이루어진다. 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다.
① DNA의 변성(denaturation)
90 C∼96 C로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킴. 보통 94 C로 쓰면, Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어짐.

② Primer의 결합(annealing)
50 C∼65 C에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 함.

참고 자료

없음