[유전공학] PCR

목차

1.primer 만들기
2.cDNA 만들기
3.PCR 하기
4.cloning 하기

본문내용

◎Primer 만들기
만들어질 cDNA의 negative strand의 3'쪽에 annealing 될 forward primer와 positive strand의 3'쪽에 annealing될 reverse primer를 17-mer로 제작한다.
나중에 vector에 cloning시키기 위해 primer 앞쪽 부분에 sticky end를 형성하는 EcoR1 site를 넣어주었다. 그런데 EcoR1은 endonuclease로 gene안쪽의 seq.만 인지 할 수 있기 때문에 그 앞쪽에 또 두개의 base를 더 넣어주었다.
forward primer: 5'-ta/gaa ttc/atg cag gcc atc aag tg-3'
reverse primer: 5'-aa/gaa ttc/tta caa cag cag gca tt-5'
◎RT-PCR로 cDNA 만들기
위의 mRNA를 template로 넣고 reverse primer와 reverse transcriptase, DNA polymerase, four dNTPs를 넣고 PCR을 돌리면 RTase에 의해 위의 mRNA와 상보적인 seq.의 negative strand가 생긴다. 다시 DNA pol에 의해 이 stand에 상보적인 positive strand가 base pairing되면서 double strands cDNA가 된다. 이 product에 RNase처리를 해주면..

참고 자료

없음