13주차_His-tagged protein purification

목차

I. Purpose

II. Theory
1. Affinity Chromatography (His-tag, Imidazole)
2. Ni-NTA agarose resin

III. Apparatus/reagent

IV. Procedure
1. His-tag Affinity Column Chromatography

V. Data&Results

VI. Discussion

본문내용

Purpose: Affinity purification의 원리를 이해하고, His6-tagged 단백질을 정제해본다.

Theory
1. Affinity Chromatography (His-tag, Imidazole)
Affinity chromatography는 친화성 크로마토그래피로, 서로 다른 물질이 갖는 특이적인 interaction을 통해 혼합물을 분리하는 기법이다. 친화성 크로마토그래피에 사용되는 column 에는 bead가 결합되어 있고, bead에는 target과 affinity가 높은 물질이 부착되어 있다. 따라서 target과 bead 사이에 작용하는 분자 간 interaction으로 인해, target은 bead에 부착되고 그 외의 impurity는 column 아래로 빠져나간다. 이러한 분리 방법은 주로 생화학적 혼합물을 분 리할 때 사용되며, 항원과 항체, 효소와 기질, 수용체와 리간드처럼 서로 긴밀한 관계에 있는 물질에 사용된다. 친화성 크로마토그래피를 위해서는 이동상에 포함된 target compound와 고 정상에 부착된 물질이 낮은 농도에서도 상호작용을 할 만큼 높은 선택성을 가져야 한다. 친화 성 크로마토그래피가 끝난 후, 완충용액을 이용해서 impurity를 세척하고, target을 bead에서 분리하기 위해 고정상과 이동상의 affinity를 낮추는 elution buffer를 넣어야 한다.
친화성 크로마토그래피는 이번 실험처럼 6x His-tag이 부착된 단백질을 정제할 때 사용될 수 있다. 먼저 6X His-tag는 Histidine 6개로 구성된 sequence로, 주로 N말단이나 C말단에 부 착된다. Histidine이 metal ion과의 complex 형성에 관여하기 때문에, histidine 연속 서열을 삽 입하면 단백질이 갖는 metal ion affinity가 증가한다.

참고 자료

Jeremy M.Berg, Biochemistry, 8th, W. H. Freeman, 2015, pp60-77