[동물세포배양] 동물세포배양의 일반적 방법

소개글

일반적인 동물세포 배양방법과 세포수를 세는 방법까지 자세한 설명을 원리와 함께 설명하였습니다.

목차

1. 세포의 계대법
1) 정상세포
2) 수립세포주
3) 부유세포의 계대법
4) 접착세포의 계대법

2. 접착세포의 Trypsin 처리

3. 세포수 계산법
1) 계산 장치의 측정원리
2) 전 세포수의 계산
3) 생세포수의 계산

본문내용

생존율을 측정하는 경우 주의점은 먼저 세포를 색소에서 염색하는 시간을 검체와 함께 일정하게 해야 한다. 염색시간이 지나치게 길면 본래 염색되지 않는 생세포까지도 청색으로 염색되고, 지나치게 짧으면 본래 염색되어야 할 사세포가 염색되지 않는 결과가 된다. 생존율을 측정하는 검체가 많은 때에는 시간차를 두어서 측정하도록 하고 모든 검체가 일정한 염색시간(5분정도)이 되도록 고려해야 한다.
다음에 주의 할 점은 계산할 세포수이다. 계산할 세포의 수가 너무 많으면 카운트할 때 계산의 오차가 생기고, 너무 적으면 생존율의 측정 오차가 크게 된다. 대충 눈대중으로 한 시야에 생세포와 사세포를 합해 100개 정도의 세포가 있는 사야에서 계산을 한다. 시야의 세포수가 많을 경우는 PBS로 희석하여 세포수를 줄이든가, 또는 시야의 반 정도 내지 4분의 1의 범위에서 계산한다.
96 well plate 등 매우 소량의 세포의 생세포수를 측정하게 위한 방법은 MTT assay와 neutral red 법이 있다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)는 담황색의 기질로서, 생세포의 미토콘드리아 내의 호흡쇄효소에 의해 개열하고 암청색의 formazan을 생성한다. 사세포에서는 이 반응이 일어나지 않는다. 생성한 formazan을 0.04N HCl-isopropanol 용액을 사용하여 세포 중에서 추출하여 570nm의 흡광도에서 정량한다. 이 formazan 의 생성량은 생세포수와 상관관계가 있으므로, 생세포수 측정에 이용한다. 한편 neutral red (3-amino-7-dimethyl amino-2-methyl-phenazine HCl)는 생세포에 들어가 lysosome에 축척된다. 이 neutral red 축적향은 생세포수에 비례하므로 생세포수의 고감도 측정법으로 이용하게 되었다. MTT assay, neutral red 등은 세포수 측정 키드로서 여러 회사에서 시판하고 있다.

참고 자료

세포공학개론