목차
1. Abstract
2. Introduction
3. Materials & Method
4. Results
5. Discussion
6. References
본문내용
Site-directed mutagenesis란 원하는 돌연변이를 포함하는 짧은 DNA primers를 사용하여 DNA 염기서열 특정 위치의 mutation을 일으켜 돌연변이를 얻는 방법이다. GFP는 빛을 흡수하여 발광하는 분자인 Chromophore를 보유하는데, β-barrel 중간에 위치하며 65Ser-66Tyr-67¬¬Gly으로 구성되어 있고, 145Tyr과 상호작용을 통해 기능한다. pGFPuv는 3337bp의 크기를 갖는 plasmid DNA로, GFPuv gene을 포함하고 있기 때문에 UV에서 많은 형광을 내는 단백질이 발현된다. GFPuv의 chromophore의 아미노산 서열인 65Ser-66Tyr-67¬¬Gly에서 66번의 Tyr이 His로 돌연변이된 Y66H mutated GFPuv는 파란색을 띄게 되며, Y66H mutated GFPuv에서 chromophore와 상호작용하는 아미노산인 145번의 Tyr이 Phe로 돌연변이가 일어난 Y66H/Y145F mutated GFPuv는 짙은 파란색을 띄게 된다. sangaer sequencing 방법으로 DNA polymerase가 작용할 때 3번탄소에 -H만 보유하고 있는 ddNTP를 만나게 되면 더 이상 중합반응을 하지 못하고 반응이 종결되는 것을 이용한다. Finch TV 프로그램으로 sequencing 결과를 확인하고, Nucleotide BLAST 웹사이트를 이용하여 ORF를 입력한 뒤, database와 비교하여 어떤 단백질인지 확인한다. mutation이 일어나 형광색이 바뀐 colony 이외에도 GFPwild type colony가 GFPY66H, GFPY66H/Y145F plate에 생성됨을 볼 수 있고 GFPY66H colony가 GFPY66H/Y145F plate에 생성되어 있는 모습을 관찰할 수 있다.
참고 자료
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