3.gel exclusion chromatography

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gel exclusion chromatography
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목차

Abstract
Introduction
◉Chromatography
Materials
Methods
Data & Result
Discussion
References

본문내용

Abstract
이번 실험은 Protein분리의 원리와 방법을 알아보는 실험으로 많은 단백질 분리방법 중 gel chromatography를 이용하여 분리하는 실험이었다. 실험에서는 Lysozyme 과 -globulin Protein mixture를 protein mixture로 사용하였고 resin은 sephacryl 200(5~250kDa분리범위)과 sephadex G-100(4~150kDa분리범위)를 사용하였다. buffer로는 sodium phosphate buffer(0.1M pH7)을 사용하였다.
Buffer를 이용해 resin washing 후 protein mixture를 loading 하고 다시 buffer를 가해 일정한 압력을 유지시켜 준 후 void volume 만큼의 buffer를 제거하고 나서(5ml - protein이 column을 통과하기 전이기 때문에 protein fraction이 존재하지 않기 때문에 측정할 필요가 없다) 1번부터 60번까지 총 60개의 e-tube에 column을 통과한protein fraction을 9방울(약 0.5ml)씩 받는다.fraction을 받는 동안 column에 채워지는 buffer의 양을 일정하게 맞춰주기 위해서 계속 buffer를 가해줘야 하는데 이 이유는 protein들이 column을 통과하는 중에 받게 되는 압력을 일정하게 해주어 일정한 속도로 내려올 수 있게 하기 위함과 resin이 마르는 것을 방지하기 위함이었다. 이렇게 60개의 e-tube에 받은 fraction을 spectrophotometer를 이용해 280nm에서 흡광도를 측정했는데 그 이유는 protein이 가장 흡광률이 좋을 때가 280nm 이기 때문이다.
이번 실험에서 우리조의 측정결과는 14번째 e-tube 에서는 peak를 나타냈지만 그 이후의 peak를 찾지 못했다. 48번 e-tube 이후 계속 O.D.값이 올라가는 결과가 나왔기 때문이었다. 하지만 우리와 같은 실험을 한 다른 조와의 결과값을 비교해 55번 e-tube에서 peak가 나와야함을 알 수 있었다.
먼저 나온 protein fraction이 더 크고 무거운 protein 이기 때문에 14번 e-tube에 담긴 protein이 Lysozyme 과 -globulin중 더 무거운 -globulin임을 확인할 수 있었고, 그 이후 55번 e-tube에 들어있을 protein이 Lysozyme 임을 알 수 있었다.
우리조의 오차의 원인은 O.D.값 측정시 cuvettes에 지문이 묻었고, cuvette washing 하면서 아래 가라앉은 부유물이 떠올라 흡광도가 높아졌을 것으로 추정한다.

참고 자료

Lubert Stryer 외 2명, Biochemistry, 5th ed, pp217~229
Modern chemistry 3rd edition, Oxtoby & Nachtrieb pp148~151
Stryer, 실험생화학, 일신사, 1976, pp128~140