column fraction chromatography 를 이용한 단백질 정제 (protein purification)와 그 실험 예.

소개글

칼럼 크로마토그래피(column chromatography) 의 원리 와 구성과 단백질정제 방법.
1. Ion-exchange Chromatography
2. Gel-filteration Chromatography
3. Affinity Chromatography
각 chromatofraphy의 원리와 단백질 정제 실험 방법, 과정, 결과 예
- 그림자료 풍부.

목차

칼럼크로마토그래피의 원리, 구성
1. ionexchange chromatofraphy
-원리
-실험방법
-실험과정
-결과분석
-실제실험 예
2. Gel-filteration chromatography
-원리
-실험방법
-실험과정
-결과분석
3. Affinity chromatography
-원리
-실험과정
-결과예

본문내용

1. Ion-exchange Chromatography


✪원리
단백질은 구성아미노산 중에 산성, 염기성아미노산을 함유하므로 적당한 pH 조건하에서는 양(+) 또는 음(-)의 전하를 가지고 있다. 이온교환체를 칼럼에 채우고 단백질 혼합물을 가하여 완충액의 pH 또는 이온강도를 변화시키면서 용출하면 각 단백질을 전하상태에 따라 분획할 수 있다. 목적 단백질이 +전하로 하전되는 염기성 단백질의 경우는 -전하를 가진 양이온 교환체에 결합시키고, -로 하전되는 산성 단백질의 경우에는 +의 전하를 가진 음이온교환체에 결합시킨다. 이 때 결합의 강도는 단백질의 총 전하의 크기에 따라 강해진다. 결합한 단백질은 용출 완충액의 이온강도(염농도)를 서서히 높이면, 결합이 약한 단백질부터 결합이 강한 단백질의 순서로 용출된다.
이온교환 크로마토그래피는 대량의 샘플을 한 번에 칼럼에 거는 것이 가능. 이온교환 크로마토그래피로 단백질을 효율적으로 분리하기 위해서는 미리 완충액의 종류나 pH 등, 목적 단백질을 칼럼에 흡착시키는 조건과 용출하기 위한 염농도 등의 조건을 정확하게 파악해 둘 필요가 있다.


✪실험방법
① Ion-exchange column을 적절한 유속으로 NaCl, NaOH, HCl이나 초산등의 순으로 세정한다.
② 완충액을 흘려 칼럼을 평형화 한다.
; 완충액을 칼럼의 bed volume의 5배량 정도씩 개시 완충액➝용출 완충액➝개시 완충액 순으로 흘리고, HPLC의 펌프에 연결하는 루프 내에 개시 완충액과 용출 완충액을 채워 둘 것. 이렇게 해 두지 않으면, 용출 시, 완충액이 칼럼에 도달하기까지 손실이 발생하기 때문에 설정한 조건대로 용출되지 않는다.
③ 샘플을 일정한 유속으로 이온교환칼럼에 첨가한다.
; 샘플의 첨가로부터 추출까지는 일정한 유속ㅇ로 실시하는 것이 바람직하다.
④ 비흡착 단백질등을 UV모니터로 확인하면서 배출되는 단백질이 없을 때 까지 개시 완충액으로 세정하여 제 거한다.

참고 자료

없음