[생화학실험]Protein Purification & SDS-PAGE

소개글

Protein Purification에 대한 여러가지 종류를 이해하고 그중에 본실험과 연관성이 있는 affinity 정제를 이해하고 GST를 기질로 하는 GSH 정제법을 해본다.
SDS-PAGE 를 이용하여 Protein 을 정제해본다

목차

■ 실험목적
■ 실험이론 및 원리
(1) Protein Purification
(2) SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-discontinuous PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
■ 실험기구 및 시약
■ 실험방법
■ 참고자료
■ 참고문헌

본문내용

■ 실험목적
• Protein Purification을 이해하고 SDS-PAGE 를 이용하여 Protein 을 정제해본다

■ 실험이론 및 원리
Cell은 수천종의 protein을 함유하고 있다. Protein은 전하, 크기, 용해도 같은 성질을 이용해 분리하며 이러한 성질은 각 protein마다 다양하다. 많은 단백질은 다른 생체분자와 결합하고 있기 때문에 단백질은 그들의 결합성질에 기초하여 분리할 수 있다.
∙ 단백질 분리 정제
∘ 전하, 크기, 용해도에 의해 분리가능
∘ Cell harvest
∘ Lysis(crude extract)
∘ Differential centrifugation
∘ Chromatography
- Ion-exchange chromatography
- Size exclusion chromatography
- Affinity chromatography(특정 물질과 결합)
(1) Protein Purification
단백질을 정제하는 목적은 크게 3가지로 요약할 수 있다.
∘ 가능한 최고의 회수율
∘ 최고의 생물학적 활성유지
∘ 최고의 순도
1) 추출 및 가용화
식물, 동물, 미생물 등의 조직, 세포 중의 단백질을 용액 중에 추출하는 것으로 정제과정이 시작된다. 조직이나 세포를 기계적인 힘으로 파쇄하여 단백질을 완충액 중으로 추출하는 경우가 많으며 세포 잔사는 원심분리하여 제거하고 상등액 중의 단백질혼합물은 다음 정제단계로 넘긴다. 어떤 종류의 단백질은 세포막 획분에 강하게 결합하고 있어 이것을 가용화하기 위해서는 여러 가지 계면활성제를 사용하거나 유기용매로 막구분을 녹여서 추출하는 경우도 있다.
2) 염석 및 유기용매에 의한 침전
염석은 물에 잘 용해하는 염(황산암모늄 등)을 단백질혼합액에 가하여 이온강도를 증가시켜 단백질을 침전시키는 것이다. 만약 목적으로 하는 단백질이 황산암모늄 60% 포화 때 주로 침전하는 것을 알면 미리 60% 포화 이하의 황산암모늄 농도로 목적 이외의 단백질을 침전시켜 제거하고 다음에 60% 포화가 되도록 황산암모늄을 가하여 목적하는 단백질을 침전시키고 이것을 원심분리로 모은다. 염석 조작은 정제의 초기 수단으로 흔히 이용된다. 유기용매에 의한 침전은 에탄올, 아세톤 등 물과 잘 혼합하는 유기용매를 단백질용액에 가해 용액의 비유전율을 변화시켜 단백질을 침전시키는 것이다. 유기용매의 농도에 따라 침전되는 단백질의 종류가 다르므로 염석의 경우와 마찬가지로 목적으로 하는 단백질을 다량으로 함유하는 침전구분을 모아 다음 정제단계로 넘긴다.

참고 자료

• Biochemistry(sixth edition), Freeman, Jeremy M.Berg, John L. Tymoczko, Lubert stryer, 69～75p , 83～88p
• Lehninger 생화학, 서울외국서적, David L. Nelson 외 1명, 132～139p